ADC靶點(diǎn)方法學(xué)開發(fā)
▏ 什么是ADC藥物
ADC（Antibody-drug conjugate，ADC）藥物全稱為抗體偶聯(lián)藥物，是將抗體通過偶聯(lián)臂（Linker）與小分子藥物（Payload）共價(jià)連接的復(fù)合物。抗體負(fù)責(zé)靶向病灶，毒素通過自身特性殺傷目標(biāo)細(xì)胞，連接子則是承擔(dān)橋接毒素和抗體直至ADC到達(dá)腫瘤細(xì)胞內(nèi)再進(jìn)行釋放的功能。一個(gè)理想的ADC分子應(yīng)該具備高靶點(diǎn)特異性、高腫瘤殺傷能力、長藥代特性、低免疫原性、低脫靶毒性。
圖1. ADC藥物的結(jié)構(gòu)圖示
▏ ADC藥物的作用機(jī)制
ADC藥物通過靜脈注射到血液中，隨著血液的流動(dòng)，到達(dá)全身，但是科學(xué)家估計(jì)只有0.1%的ADC能到達(dá)患者的癌細(xì)胞。大部分會(huì)在循環(huán)系統(tǒng)和其他器官及組織中逐漸分解。到達(dá)癌細(xì)胞的ADC藥物一般是經(jīng)歷6個(gè)過程來起作用。
1. ADC藥物進(jìn)入血液循環(huán)；
2. ADC藥物與癌細(xì)胞表面抗原結(jié)合；
3. ADC藥物通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞進(jìn)入腫瘤細(xì)胞；
4. 溶酶體通過組織蛋白酶和纖溶酶降解ADC藥物；
5. 在癌細(xì)胞中釋放Payload，藥物結(jié)合到靶點(diǎn)蛋白；
6. 毒性分子誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，細(xì)胞破裂，同時(shí)部分ADC藥物也可能殺死周圍的癌細(xì)胞。
圖2. ADC藥物的作用機(jī)制模型
▏ ADC藥物活性評(píng)價(jià)平臺(tái)
1. ADC藥物與抗原結(jié)合能力檢測
1.1 bio-chemical assay
首先在生化水平(bio-chemical assay)上，可以采用ELISA的方式檢測ADC藥物與抗原的結(jié)合能力，常見的有Total Antibody ELISA、Conjugated Antibody ELIA、Conjugated drug ELISA。同樣的，針對(duì)PPI（Protein-Protein Interaction），biacore是一個(gè)強(qiáng)大的工具，可以得到更全面的動(dòng)力學(xué)結(jié)合分析數(shù)據(jù)。
圖3. ELISA方法檢測ADC藥物和抗原靶點(diǎn)的結(jié)合
1.2 Cell-based assay
一般生化水平檢測完，就需要做細(xì)胞水平(Cell-based assay)的結(jié)合能力檢測,可以選擇靶點(diǎn)陽性的細(xì)胞來進(jìn)行，一般可以同時(shí)選擇不表達(dá)、低表達(dá)、中表達(dá)、高表達(dá)的細(xì)胞一起做，檢測方法一般采用流式細(xì)胞術(shù)（FACS）來檢測。
科佰Cell-Panorama數(shù)據(jù)庫是完全免費(fèi)開源的數(shù)據(jù)庫，數(shù)據(jù)庫整合了2000多種細(xì)胞的RNA-seq數(shù)據(jù)，我們知道m(xù)RNA表達(dá)和蛋白表達(dá)相關(guān)系數(shù)只有約0.6左右，因此蛋白組的數(shù)據(jù)更有參考價(jià)值。可貴的是科佰正在構(gòu)建全國最大的蛋白組數(shù)據(jù)庫（陸續(xù)新增中），屆時(shí)免費(fèi)向我們的客戶公開。
圖4. 科佰生物現(xiàn)貨腫瘤細(xì)胞庫組織分類示意圖
現(xiàn)貨細(xì)胞列表，請(qǐng)點(diǎn)擊訪問
同時(shí)科佰構(gòu)建了300多株過表達(dá)ADC靶點(diǎn)的工程細(xì)胞株，全部是現(xiàn)貨供應(yīng)，可以用于多種cell-based assay，比如ELISA、FACS、凋亡、增殖抑制等。
表1. 科佰生物部分現(xiàn)貨ADC靶點(diǎn)過表達(dá)工程細(xì)胞株列表
更多現(xiàn)貨ADC細(xì)胞模型，請(qǐng)點(diǎn)擊訪問
2. ADC藥物的ADCC/ADCP/CDC效應(yīng)
ADC藥物中針對(duì)腫瘤相關(guān)抗原的抗體，同樣也會(huì)存在ADCC和ADCP效應(yīng)。簡而言之，抗體的Fab端與腫瘤細(xì)胞結(jié)合，抗體的Fc端，會(huì)與效應(yīng)細(xì)胞的FcγR結(jié)合，通過抗體連接腫瘤細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞，則效應(yīng)細(xì)胞就可以釋放因子來殺死或者吞噬腫瘤細(xì)胞。
圖5. ADCC/ADCP/CDC原理示意圖
科佰生物開發(fā)了多種ADCC/ADCP的模型，采取的是報(bào)告基因的檢測方法，Luc的報(bào)告基因?qū)儆诨瘜W(xué)發(fā)光，是一種不需要激發(fā)光、本底噪音信號(hào)較低的方法學(xué)，靈敏度高，適用于ADC藥物的檢測。
| 貨號(hào) | 模型名稱 | 應(yīng)用 |
| CBP74002 | ADCC Bioassay Effector Cell F variant (Low Affinity)- Fcγ-NFAT/Jurkat | Functional(Report Gene) Assay |
| CBP74003 | ADCC Bioassay Effector Cell V variant (High Affinity)-Fcγ-NFAT/Jurkat | Functional(Report Gene) Assay |
| CBP74076 | Mouse ADCC Bioassay Effector Cell | Functional(Report Gene) Assay |
表2. 科佰生物現(xiàn)貨ADCC現(xiàn)貨工程細(xì)胞株
| 貨號(hào) | 模型名稱 | 應(yīng)用 |
| CBP74105 | ADCP Bioassay Effector Cell FcγRIa -NFAT/Jurkat | Functional(Report Gene) Assay |
| CBP74106 | ADCP Bioassay Effector Cell FcγRIIa (H variant) -NFAT/Jurkat | Functional(Report Gene) Assay |
| CBP74004 | ADCP Bioassay Effector Cell FcγRIIa (R variant) -NFAT/Jurkat | Functional(Report Gene) Assay |
表3. 科佰生物現(xiàn)貨ADCP現(xiàn)貨工程細(xì)胞株
3. ADC藥物的內(nèi)吞
ADC藥物與腫瘤細(xì)胞表面的抗原結(jié)合后，會(huì)觸發(fā)受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用，ADC藥物被內(nèi)吞進(jìn)入溶酶體中，溶酶體提供連接抗體和藥物的連接體裂解所需的酸性環(huán)境和酶，從而釋放細(xì)胞毒性有效載荷。常見的內(nèi)吞機(jī)制分為“ 網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用”和“不依賴網(wǎng)格蛋白的內(nèi)吞作用”。
ADC藥物的內(nèi)吞作用是藥物起效的前提，內(nèi)吞動(dòng)力學(xué)的研究能很好的幫助分析藥物的內(nèi)吞過程、內(nèi)吞效率、監(jiān)測有效載荷的釋放。經(jīng)典的內(nèi)吞動(dòng)力學(xué)研究，多用酸性PH敏感的熒光染料來標(biāo)記ADC抗體。一般而言，胞外的PH為7.4左右，細(xì)胞質(zhì)的PH為7.0-7.2左右，而進(jìn)入溶酶體后，PH值會(huì)有明顯的下降，可以達(dá)到PH 4.7左右。在中性的環(huán)境下，沒有熒光，進(jìn)入溶酶體，變成酸性環(huán)境后，PH敏感的熒光染料，就會(huì)發(fā)出熒光信號(hào)。
圖6. Incucyte系統(tǒng)，可以長期觀察多個(gè)時(shí)間點(diǎn)和濃度的細(xì)胞培養(yǎng)物
4. 載荷的毒性作用評(píng)價(jià)
ADC藥物從溶酶體中釋放有效載荷，這些載荷按照預(yù)期是可以殺死腫瘤細(xì)胞，常見的有效載荷分為幾類：
表4. 常見Payload的類型
4.1微管抑制劑(Microtubule Inhibitors):
這類載荷通過干擾細(xì)胞微管的正常功能，抑制細(xì)胞分裂和增殖。常見的微管抑制劑包括：
MMAE/MMAF:一類auristatin類化合物，通過抑制微管蛋白聚合發(fā)揮細(xì)胞毒性。
DM1/DM4:一類maytansinoid類化合物，同樣作用于微管蛋白。
4.2DNA損傷劑(DNA-damaging agents):
這類載荷通過損傷DNA，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。常見的DNA損傷劑包括：
卡奇霉素(Calicheamicin):一種內(nèi)酯類抗生素，通過與DNA結(jié)合并產(chǎn)生自由基，導(dǎo)致DNA雙鏈斷裂。
吡咯并苯并二氮雜卓類(PBDs):通過與DNA小溝結(jié)合，導(dǎo)致DNA交聯(lián)，阻止DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。?
4.3 拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑(Topoisomerase Inhibitors):
這類載荷通過抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶的活性，影響DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。常見的拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑包括：
SN38/DXd:一類喜樹堿衍生物，是拓?fù)洚悩?gòu)酶I的抑制劑。
4.4 其他類型的載荷:
除了上述主要類別，還有一些其他類型的載荷正在開發(fā)中，例如：RNA聚合酶II抑制劑:通過抑制RNA聚合酶II的活性，影響RNA轉(zhuǎn)錄。其他新型細(xì)胞毒性藥物:例如杜卡霉素、PNU-159682、鵝膏蕈堿等。
不同的載荷有不同的作用機(jī)制和毒性特征，因此常見的評(píng)價(jià)有效載荷的毒性作用，我們可以采取細(xì)胞增殖抑制檢測、細(xì)胞凋亡檢測、細(xì)胞周期檢測等手段。
細(xì)胞增殖抑制檢測一般采用CTG、CCK8檢測藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的抑制效果。以CTG為例，主要是檢測活細(xì)胞中的ATP，以熒光素酶的催化發(fā)光作為最終的讀數(shù)，是一種化學(xué)自發(fā)光的檢測，靈敏度高。
圖7. CTG法檢測ADC藥物的腫瘤細(xì)胞抑制
細(xì)胞凋亡檢測有很多方法，常見的有FACS檢測Annexin V/PI double staining、檢測Caspase、DNA碎片分析、TUNEL等，這些方法可以稱為是半定量，一般不適用于四參數(shù)擬合，計(jì)算藥效的EC50。
圖8. 通過檢測凋亡評(píng)定ADC藥物的毒性
有些ADC藥物的有效載荷是針對(duì)DNA復(fù)制相關(guān)的毒素，就會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞周期的阻滯效果，比如Dxd毒素會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞停滯在G2/M期。
圖9. 細(xì)胞周期分析ADC藥物有效載荷的作用
5. ADC藥物的旁觀者效應(yīng)
旁觀者效應(yīng)（Bystander efficacy）是指部分ADC藥物的有效載荷在釋放后可以滲透穿過細(xì)胞膜，進(jìn)入到腫瘤微環(huán)境中，或者陽性細(xì)胞凋亡破裂后釋放有效載荷，滲透進(jìn)入靶點(diǎn)陰性的腫瘤細(xì)胞并進(jìn)行殺傷。
旁觀者效應(yīng)在ADC藥物的殺傷作用中非常重要，一般用于評(píng)價(jià)旁觀者效應(yīng)的體外藥效的方法有兩種：（1）共培養(yǎng)體系，（2）介質(zhì)轉(zhuǎn)移法。細(xì)胞共培養(yǎng)（co-culture)是將兩種細(xì)胞（抗原陽性Ag+、抗原陰性Ag-）混合共同培養(yǎng)，比較Ag-在共培養(yǎng)系統(tǒng)和單一培養(yǎng)系統(tǒng)中的活力，可以通過檢測腫瘤細(xì)胞的增殖抑制來比較。介質(zhì)轉(zhuǎn)移法是先用一定量的ADC處理Ag+細(xì)胞，一段時(shí)間后，將該介質(zhì)轉(zhuǎn)移到Ag-細(xì)胞。如果來自Ag+細(xì)胞的介質(zhì)對(duì)于Ag-比直接用同樣濃度的ADC處理體現(xiàn)出更好的殺傷效果，那么就可以說明具有旁觀者效應(yīng)。
以下以共培養(yǎng)體系為例，介紹體外方法學(xué)的開發(fā)。
5.1 單一培養(yǎng)體系
因?yàn)锳DC藥物的作用機(jī)制顯示，一來需要ADC藥物的抗原結(jié)合、內(nèi)吞、酶切，二來部分有效載荷是跟細(xì)胞周期有關(guān)，需要細(xì)胞積累阻滯，因此一般做旁觀者效應(yīng)之前需要先摸索藥物的作用時(shí)間（一般建議至少2個(gè)倍增周期）和有效濃度，來確保對(duì)陽性細(xì)胞Ag+細(xì)胞的殺傷。
表5. 單一培養(yǎng)體系96孔板Layout設(shè)計(jì)
通過四參數(shù)擬合得到Ag+和Ag-細(xì)胞的殺傷曲線，計(jì)算出Ag+細(xì)胞的IC90，計(jì)算出Ag-細(xì)胞的IC50，注意這里建議藥物的濃度建議使用有效載荷濃度（非ADC藥物濃度）來做數(shù)據(jù)擬合。在下一步的細(xì)胞共培養(yǎng)體系中，可以選擇大于Ag+細(xì)胞IC90、同時(shí)小于Ag-細(xì)胞的IC50的濃度，來測試旁觀者效應(yīng)。
5.2 共培養(yǎng)體系
在做共培養(yǎng)之前，我們需要明確幾點(diǎn)：
① 最好Ag-細(xì)胞帶Luc的標(biāo)記，這樣屆時(shí)檢測時(shí)，只要針對(duì)Luc做信號(hào)檢測即可；
② 因?yàn)锳g-的殺傷來自于Ag+細(xì)胞的殺傷釋放，因此需要摸索不同的Ag+和Ag-共培養(yǎng)的細(xì)胞比例關(guān)系；
③ 旁觀者效應(yīng)需要的時(shí)間更長，如果細(xì)胞培養(yǎng)中，涉及添液（不可換液）的操作，則會(huì)稀釋毒素的濃度，進(jìn)而影響對(duì)Ag-細(xì)胞的殺傷；
④ 實(shí)驗(yàn)中有各種因素會(huì)影響到這種長周期的細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)，因此我們一般是通過與Ag-單一細(xì)胞模型比較來判斷是否存在旁觀者效應(yīng)。
常見的設(shè)計(jì)如下：
表6. 共培養(yǎng)體系96孔板Layout設(shè)計(jì)
6. 體內(nèi)藥效評(píng)價(jià)
體內(nèi)評(píng)價(jià)ADC藥物的活性，可以將細(xì)胞接種到小鼠上，做CDX模型。通過小鼠的皮下瘤、原位瘤的變化來檢測ADC藥物的藥效。同時(shí)如果做旁觀者效應(yīng)的話，可以在Ag-的細(xì)胞上做Luc的標(biāo)記，用活體動(dòng)物成像來檢測瘤的變化。
科佰生物提供3類細(xì)胞產(chǎn)品助力體內(nèi)的藥效評(píng)價(jià)，除了1.2中提供的1500多株腫瘤細(xì)胞、300多株過表達(dá)的工程細(xì)胞外，還提供160多種Luc標(biāo)記的示蹤細(xì)胞，在接種皮下瘤時(shí)，可以通過活體成像來檢測瘤子的變化。
表7. 科佰生物部分現(xiàn)貨示蹤Luc細(xì)胞的清單展示
▏ 總結(jié)
中國藥企在ADC等領(lǐng)域經(jīng)過多年技術(shù)沉淀后，已具備開發(fā)first in class（FIC）突破性療法的實(shí)力，并且能夠在新興賽道上擔(dān)當(dāng)全球先鋒。回顧過去，國內(nèi)獲批的ADC藥物更多是fast-follow策略下的成功實(shí)踐，這類藥物也在海外市場獲得了一定認(rèn)可，吃到了一波出海紅利，落地了大量BD交易，為國內(nèi)創(chuàng)新藥出海積累了寶貴經(jīng)驗(yàn)。
表8. 本文思路總結(jié)
