Cellular cyclic AMP Detection KIT是一種競爭性的檢測技術(shù)，檢測細胞內cAMP的量。藥物同貼壁細胞或者懸浮細胞共處理后，能通過(guò)此KIT檢測出藥物對細胞的作用。
 

      檢測原理采用TR-FRET檢測技術(shù)。細胞內天然的cAMP同cAMP-Probe競爭性結合Eu -Anti-cAMP。最終檢測出來(lái)的信號與樣本中cAMP的濃度成反比。
 

      熒光比值665nm/620nm可以消除背景信號的干擾，意味著(zhù)檢測不受實(shí)驗培養基條件（例如培養基、血清、生物素、有色化合物等）的影響。

1. 384淺孔板：Greiner#784075，PerkinElmer# Proxiplate 6008280，也可以應用于96孔板和1536微孔板。
 

2. 酶標儀：BMG  PHERAstar ，PerkinElmer Envision.
 

3. IBMX(Sigma#I5879-1G) 是最常用的磷酸二酯酶泛抑制劑，它能保證細胞中 cAMP 的高水平積累而不被降解。 
 

4. Foskolin(MCE#HY-15371) 可激活腺苷酸環(huán)化酶并增加細胞內 cAMP 水平，它可用作 Gs 應用的陽(yáng)性對照。Forskolin也可以用作Gi 偶聯(lián)受體研究。

1. Stimulation Buffer :取1體積的Stimulation Buffer，加上4體積的ddH2O，稀釋5倍，1X的 Stimulation Buffer現配現用。
 

2.檢測試劑的配制：（1）cAMP-Probe (100X) 取1體積的cAMP-Probe，加上99體積的Lysis & Detection Buffer，稀釋100倍備用。（2）Eu -Anti-cAMP (100X)取1體積的Eu -Anti-cAMP，加上99體積的Lysis & Detection Buffer，稀釋20倍備用。
 

3. IBMX: 用DMSO配制IBMX的stock 溶液0.5M，常用的工作濃度是0.5mM，用1X的Stimulation Buffer稀釋1000倍，現配現用。
 

4. Forskolin: 用DMSO配制Forskolin的stock 溶液10mM，根據實(shí)驗需要，可以用1X的Stimulation Buffer稀釋成不同的濃度備用。

      測試標準品的反應曲線(xiàn)，以確定實(shí)驗室中Stimulation Buffer或者細胞培養基的檢測線(xiàn)性動(dòng)態(tài)范圍。這還將驗證實(shí)驗中是否產(chǎn)生了預期的 S/B 和 cAMP的IC50值。
 

      特別是IC10 和 IC90的數值將在實(shí)驗中非常有用，可以用于優(yōu)化細胞系的細胞密度。
 

      測試標準品的反應曲線(xiàn)，以確定實(shí)驗室中Stimulation Buffer或者細胞培養基的檢測線(xiàn)性動(dòng)態(tài)范圍。這還將驗證實(shí)驗中是否產(chǎn)生了預期的 S/B 和 cAMP的IC50值。
 

      特別是IC10 和 IC90的數值將在實(shí)驗中非常有用，可以用于優(yōu)化細胞系的細胞密度。
 

計算每個(gè)孔的受體和供體發(fā)射信號的比例

Ratio=665nm的信號值/620nm的信號值, 四參數擬合曲線(xiàn)如下圖
 

1. 必須優(yōu)化各種細胞參數，這些參數取決于要篩選的化合物的類(lèi)型（激動(dòng)劑或拮抗劑）以及要篩選的GPCR 的G 蛋白類(lèi)型（Gs或 Gi）。這些參數包括細胞密度、IBMX 濃度、激動(dòng)劑濃度（用于拮抗劑篩選）和藥物刺激時(shí)間。
 

2. 必須優(yōu)化細胞密度，以確保刺激細胞的 cAMP 水平在測定的線(xiàn)性動(dòng)態(tài)范圍內（IC10 至 IC90）。如果結果超出測定的線(xiàn)性范圍，數據將不準確。
 

3.化合物建議在1X的Stimulation Buffer 中稀釋?zhuān)瑢τ诔^(guò) 2 小時(shí)的刺激時(shí)間，化合物可以在細胞培養基中稀釋。

計算每個(gè)孔的受體和供體發(fā)射信號的比例

Ratio=665nm的信號值/620nm的信號值