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突變頻率AF的稀釋?zhuān)阂吧筒缓蛔兊募毎岛怂崤c含有特定突變的細胞系核酸進(jìn)行混合，對于A(yíng)F突變頻率的稀釋通常不能簡(jiǎn)單考慮野生型核酸及突變核酸的質(zhì)量比，而需要突變基因位點(diǎn)的原始頻率，突變及野生型基因核酸所含的目的基因拷貝數，野生及突變型核酸樣本的基因組整體分子量（染色體倍性）等多個(gè)維度進(jìn)行考慮，科佰生物開(kāi)發(fā)了一套獨特的算法，將上述因素均納入該計算方法中，使得計算的理論突變及野生型核酸混合比例最大程度的精確，同時(shí)對稀釋后的樣品進(jìn)行數字PCR絕對定量，再根據定量的結果對與理論AF%值有一定偏差的結果進(jìn)行微調以后再次數字PCR定量，使得稀釋樣品的AF%處于使用預期的合理范圍內濃度的稀釋?zhuān)阂话鉭DNA濃度在40ng/ul，如果需要低濃度，那么使用對應的緩沖液對產(chǎn)品進(jìn)行稀釋。

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科佰的突變頻率AF是通過(guò)數字PCR檢測的，誤差范圍如下：

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AF檢測結果不符合預期的原因可能是多方面，通常有以下幾個(gè)常見(jiàn)的原因，1）技術(shù)平臺方法學(xué)的差異，COA呈現的AF值及誤差范圍是基于數字PCR絕對定量計算的結果，當標準品用其它方法學(xué)檢測時(shí)(例如NGS),這種AF的偏差可能被放大，這種放大又和檢測突變的類(lèi)型，目的基因的拷貝數及序列的特殊性，樣本的染色體倍性，具體采用的實(shí)驗技術(shù)路線(xiàn)，以及后期的生信分析方法相關(guān)，具體來(lái)說(shuō)1）當突變?yōu)镾NV時(shí)一般數字PCR與NGS獲得的AF值偏差較小，而CNV及融合突變的AF值偏差較大，從實(shí)驗的角度數字PCR是完整的gDNA樣品進(jìn)行一個(gè)擴增定量，而NGS建庫過(guò)程中往往需要對樣品進(jìn)行打斷，打斷通常容易使CNV及融合突變的AF與打斷前發(fā)生一定的偏差，我們用數字PCR對打斷前后的CNV及融合突變樣品檢測往往也會(huì )觀(guān)察到這個(gè)現象，這種打斷以后產(chǎn)生的差異我們在一些整體染色體倍性異常的樣品上也有所發(fā)現, 另外從檢測后的生信分析角度來(lái)看，SNV AF值的計算分析方法相對成熟統一，也更接近于數字PCR AF值的計算原理，所以NGS和數字PCR結果之間往往差異較小，而CNV和融合突變的AF計算更依賴(lài)于生信算法，方案不太統一成熟，各家算法差異較大，這也是導致其與數字PCR定標AF存在較大差異的原因之一。此外，從方法學(xué)角度，數字PCR只是簡(jiǎn)單的一次PCR的絕對定量方法，而NGS方法無(wú)論是擴增子還是捕獲方案，建庫及測序過(guò)程中可能都涉及多次或多重PCR，PCR的過(guò)程會(huì )產(chǎn)生一些偏向性擴增，導致AF值發(fā)生一定偏離，我們也曾通過(guò)一些數字PCR實(shí)驗驗證發(fā)現某些樣本和位點(diǎn)建庫前和建庫后的PCR產(chǎn)物AF值存在差異；另外，某些NGS測序深度不足或者不均一也會(huì )導致AF值與預期不符，例如某些GC含量過(guò)高或過(guò)低的區域位點(diǎn)，可能會(huì )存在深度與其它區域比不均一的情況，導致AF偏離， 另外對于某些拷貝數擴增，且擴增數比較高的位點(diǎn)，會(huì )存在局部測序深度不夠，導致檢測上限低于真實(shí)拷貝數，需要更高的測序深度才能反映真實(shí)的拷貝數。

以上只是一些常見(jiàn)的AF值偏離的原因，總而言之，AF值不符的原因是多方面且復雜的，具體案例還需要具體分析，當遇到實(shí)際案例時(shí)可能我們需要客戶(hù)的一些原始數據和實(shí)驗細節才能便于我們分析原因。

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科佰生物的標準品來(lái)源的細胞系是含有一些內源性突變的，這些突變的全外顯子測序結果可以在購買(mǎi)后咨詢(xún)我們的銷(xiāo)售人員獲取。

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160bp±10%的DNA片段，模擬液體活檢病人樣本；由①gDNA超聲打斷或②酶切處理染色體后提取獲得；可提供純化后的ctDNA片段，也可以將ctDNA 按一定的濃度溶入人工血漿中模擬臨床上未純化的血漿樣本，我們一般不對產(chǎn)品提供末端修復，客戶(hù)可根據自己的應用場(chǎng)景需要自行進(jìn)行修復。

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FFPE標準品是將一定數量的特定突變細胞福爾馬林固定，包埋形成石蠟塊形式；石蠟塊切片制作為石蠟切片形式。

試劑盒：

QIAamp DNA FFPE Tissue Kit (Qiagen)

Qubit dsDNA HS Assay Kit (Thermo Fisher Scientific) 

規格提取量：>400 ng per two slides with 15 μm/slide

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參考 從《指導原則》中分析參考品盤(pán)設計

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1）數字PCR的引物探針針對SNV，或者較短的Indel (如EGFR 19Del, 20Ins等)，通常包含一對引物，以及兩條分別標記不同熒光基團（例如FAM/VIC, FAM/HEX等）的探針用于識別突變及野生型拷貝數。

2）數字PCR的引物探針針對CNV,通常包含兩對不同的引物及兩條標記不同熒光基團（例如FAM/VIC, FAM/HEX等）的探針，用于分別擴增識別定量目的基因及內參基因的拷貝數。（內參基因一般選擇較為保守不易發(fā)生拷貝數變異的基因，例如RPP30，盡管內參基因拷貝數相對保守，不易發(fā)生拷貝數異常，但這不是絕對的，有時(shí)為了提高檢測的準確性，可以考慮選擇兩到三個(gè)不同的內參基因來(lái)比較，提高檢測的準確性）。

3）數字PCR的引物探針針對DNA融合突變，通常包含兩對不同的引物及兩條標記不同熒光基團（例如FAM/VIC, FAM/HEX等）的探針，用于分別擴增識別定量目的基因突變BREAKPOINT拷貝數及總的目的基因拷貝數。

4）數字PCR的引物探針針對RNA，通常包一對引物及一條標記熒光基團的探針，用于擴增識別定量目的基因拷貝數。