慢病毒整合位點(diǎn)標準品強勢來(lái)襲

發(fā)布時(shí)間:2024/11/11分類(lèi):技術(shù)文章來(lái)源:科佰生物

嵌合抗原受體T細胞（Chimeric antigen receptor Tcell, CAR-T）免疫療法是將應用基因修飾技術(shù)制備表達，嵌合抗原受體(Chimeric antigen receptor, CAR)的T淋巴細胞，經(jīng)體外擴增后再回輸至患者體內的一種個(gè)體化治療方法。

近年來(lái)，隨著(zhù)Kymriah, Yescarta 以及 Strimvelis等細胞治療產(chǎn)品陸續推上市場(chǎng)，慢病毒作為細胞裝載CAR過(guò)程的關(guān)鍵中間載體，確保慢病毒為基礎的藥物質(zhì)量和安全性挑戰巨大。去年年底FDA公布調查CAR-T療法的安全性問(wèn)題—T細胞癌癥風(fēng)險的出現被認為源于其使用的基因遞送載體-慢病毒載體后，于今年1月31日正式發(fā)布“ Considerations for the development of Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cell Products”指導原則。當中建議根據風(fēng)險評估來(lái)確定載體拷貝數（VCN）的放行標準。風(fēng)險評估包括插入位點(diǎn)分析、克隆優(yōu)勢、劑量、適應癥、研究人群等研究支持的實(shí)驗數據。國家藥品監督管理局藥品審批中心（CDE）發(fā)布的《基因修飾細胞治療產(chǎn)品非臨床研究與技術(shù)指導原則》也將“插入突變風(fēng)險評估”作為非臨床安全性研究的內容，并詳細規定關(guān)鍵風(fēng)險因素的評估要點(diǎn)，因此CAR-T治療需要評估潛在的插入突變風(fēng)險和致癌性風(fēng)險。

慢病毒整合位點(diǎn)檢測方法

目前檢測慢病毒整合位點(diǎn)的主要平臺為高深度測序（NGS)。

Table 1. 常見(jiàn)慢病毒整合位點(diǎn)檢測方法比較

綜合考慮，科佰選擇多種方法（捕獲探針?lè )y序+ sanger + ddPCR）驗證，充分驗證標準品的準確性。在驗證過(guò)程中，捕獲探針?lè )y序技術(shù)針對慢病毒整合位點(diǎn)檢測的準確性得到了很好的驗證。

慢病毒整合位點(diǎn)標準品

我國在2021年連續出臺了4部基因治療相關(guān)產(chǎn)品的指導原則都指出慢病毒整合檢測至少要包含1. 整合方向 2. 整合位置 3. 特定整合位置和整合方向的絕對克隆數目。

針對這一要求，科佰現推出慢病毒整合位點(diǎn)標準品。

部分產(chǎn)品數據展示：

Fig 1. Results of CBPL0002 by NGS (Probe capture method).

通過(guò)NGS（捕獲探針?lè )y序）技術(shù)，結合生信分析方法，選取1000×以上Reads數的基因進(jìn)行Sanger以及ddPCR法驗證，同時(shí)采用ddPCR方法檢測整合頻率。多種方法相結合，準確定位慢病毒插入位點(diǎn)以及整合頻率。

Fig 2.Results of CBPL0002 by Sanger sequencing.

Fig 3.Results of CBPL0002 by ddPCR.

根據NGS（捕獲探針?lè )y序）結果確定慢病毒插入位點(diǎn)，通過(guò)Sanger測序以及ddPCR法再次驗證，準確定位慢病毒插入位點(diǎn)以及整合頻率。

CAR-T細胞療法被認為是最有前途的癌癥治療方法之一，其在血液系統瘤中的運用已取得了優(yōu)異的療效，可靠的檢測方法可以準確有效分析慢病毒插入位點(diǎn)，協(xié)助客戶(hù)評估插入突變的可能性以及相關(guān)的風(fēng)險，提高細胞免疫治療的安全性。

慢病毒整合位點(diǎn)檢測服務(wù)

科佰現推出針對慢病毒整合位點(diǎn)檢測服務(wù)（捕獲探針?lè )y序技術(shù)）。捕獲探針?lè )y序技術(shù)主要是針對LTR區域做探針捕獲，PCR后，NGS測序驗證，結合生信分析方法，判斷慢病毒插入位點(diǎn)。后續同時(shí)采用了sanger以及ddPCR方法對NGS(捕獲探針?lè )y序)技術(shù)進(jìn)行了驗證，NGS(捕獲探針?lè )y序)檢測出的位點(diǎn)，sanger以及ddPCR方法均檢出。